熒光染色細胞凋亡檢測試劑盒

熒光染色細胞凋亡檢測試劑盒

活細胞透過性熒光染料Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞膜通透性發生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細胞膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的多。此外，還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等有關。Hoechst 33342進入凋亡細胞中比正常細胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細胞膜完整的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在不經固定的情況下對這些染料是拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。
本試劑盒就是采用Hoechst 33342與另一種活細胞非透過性熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，直接對活細胞的染色體DNA進行特異性熒光染色。在熒光顯微鏡下觀察，可見凋亡細胞明亮的藍色細胞核熒光著色，而正常細胞著色很淺，壞死細胞則會被PI著色產生紅色熒光，從而區分出凋亡和壞死細胞。熒光染色的培養細胞也可直接用于流式細胞分析，是一種快速、簡便、經典的細胞凋亡檢測方法。該產品特點如下：
1．特異性強：利用凋亡細胞的包膜結構完整性和核形態特征性改變區分凋亡和壞死 
     細胞
2．快速簡便：適合高通量篩選
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
實驗步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉錄合成cDNA;
3、PCR擴增;
4、產物的電泳和結果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進行。
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
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