多點突變試劑盒

多點突變試劑盒

本試劑盒是利用一對設計特殊的錨定引物（Anchor Primer）及幾條定點突變引物對DNA多個不同位點同時進行定點突變的試劑盒。錨定引物“尾巴”上的特異性序列是與大多數基因都不相匹配的，因此保證了PCR擴增的特異性。本試劑盒的主要原理是：設計合成同一方向的錨定引物及定點突變引物，將錨定引物及定點突變引物用T4聚核苷酸激酶磷酸化后與模板質粒DNA進行退火，再使用T4 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶進行延伸和連接形成突變單鏈，然后使用錨定引物“尾巴”上的特異性引物（ETail F/ETail R）和高保真DNA聚合酶對突變單鏈進行PCR擴增，再將獲得的雙鏈PCR產物克隆回原載體中，即可達到實驗目的，獲得目的突變體。本試劑盒操作快速簡單，只需一天時間便可以完成整個突變操作。本試劑盒尤其適用于插入片段長度在1.0 kb以下的多位點基因突變實驗，對于1.0 kb以上的DN段的多位點基因突變，由于引物退火的不完全、PCR擴增中可能引入新的突變點等原因，可能降低實驗成功率。本公司曾經使用本試劑盒，成功進行了1.5 kb DN段的多位點基因突變實驗。本試劑盒中的Anchor F1和Anchor R1引物可供克隆于pUC系列載體或pBluescript系列載體中的DN段的多位點基因突變實驗，使用方便。使用試劑盒中的Control質粒及各種Control實驗用引物可進行Control實驗。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質。
實驗步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉錄合成cDNA;
3、PCR擴增;
4、產物的電泳和結果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進行。
堿變性提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性。質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離，當以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調節其pH至中性時，變性的質粒DNA又恢復原來的構型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。
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